火龙果属仙人掌科三角柱属
火龙果属仙人掌科三角柱属，红肉火龙后品原产于墨西哥、果采中美洲和南美洲，质劣因其健康特性和营养价值受到重视而被广泛种植。变及目前，苹果市面上常见的酸代火龙果品种主要有：白肉火龙果、红肉火龙果和紫红肉火龙果3种。谢研其中，红肉火龙后品红肉火龙果果肉中富含白肉火龙果所缺少的果采甜菜色素，还含有丰富的质劣不饱和脂肪酸、水溶性食物纤维等。变及除了有较高的苹果营养价值外，红肉火龙果在抗氧化方面对人体也有一定的酸代辅助作用。
果实中有机酸的谢研组成与含量是影响果实风味品质的重要因素。果实中存在许多种类的红肉火龙后品有机酸，然而大多数果实通常以1种有机酸为主，少数以多种为主。根据主要有机酸的种类，可以将果实分为苹果酸型果实、柠檬酸型果实和酒石酸型果实等。果实中的有机酸代谢是一个复杂的生理过程，由有机酸的合成和降解共同决定。有研究表明，苹果酸是火龙果的主要有机酸。苹果酸脱氢酶(NAD-MDH)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)和苹果酸酶(NADP-ME)是苹果酸代谢中关键的3个酶，前两者催化苹果酸的合成，后者则参与苹果酸的降解，它们共同调节了火龙果生长发育过程中苹果酸的代谢和积累，其含量是一个动态变化的过程，可影响火龙果的风味品质。
目前关于红肉火龙果中苹果酸的代谢变化还未见研究报道。本试验研究了“玫瑰香”品种和“大红一号”品种火龙果贮藏过程中的品质变化和苹果酸代谢关键基因NADP-ME、PEPC和NAD-MDH的表达差异，为进一步研究红肉火龙果采后贮藏过程中苹果酸积累的调控机制和对风味特性形成的影响提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料
“玫瑰香”品种火龙果，采自浙江省江山市秋实家庭农场；“大红一号”品种火龙果，采自浙江省诸暨市雪锋火龙果基地，保鲜车运回实验室后置于10℃冷库中预冷12h。
1.1.2 试剂
磷酸二氢钾、磷酸、福林-酚等(分析纯级)，购自国药集团化学试剂有限公司；色谱级甲醇、色谱级乙腈，购自美国迪马科技公司；草酸、酒石酸、苹果酸、乳酸、柠檬酸、富马酸及琥珀酸标准品，购于阿拉丁试剂(上海)有限公司；异硫氰酸苯酯、三乙胺、游离氨基酸混标，购于美国Sigma试剂公司：PEPC测定试剂盒。购于南京建成生物工程研究所。
1.2 仪器与设备
TAXTPlus型质构仪，英国SMS公司：PAL-1型手持折射仪，日本ATAG0公司；877Titrinoplus自动电位滴定仪，瑞士万通股份有限公司；UV-9000紫外-可见分光光度计，上海元析仪器有限公司：Waters高效液相色谱仪(型号e2695-2998配有PDA检测器)，沃特世科技(上海)有限公司；微量分光光度计，日本SHIMADZY公司；恒温扩增PCR仪，美国赛默飞世尔科技公司：微量核算蛋白测定仪，美国赛默飞世尔科技公司：The瑚oMR23i高速低温冷冻离心机。法国捷安特集团股份有限公司。
1.3 试验方法
挑选无机械损伤，果实大小和成熟度相对一致的“玫瑰香”火龙果和“大红一号”火龙果。用2％次氯酸钠浸泡消毒后自然晾干，于25℃恒温培养，每组3次重复。分别在贮藏第0，1，2，3，4，5，6。7，8天定期取样，置于液氮中迅速冻存，混合后分装至样品袋中，于-80℃保存。用于后续品质指标测定。
1.3.1 硬度的测定
参考黄子娟的方法。并稍作修改。采用质构仪测定火龙果的果皮硬度和果肉硬度，使用直径2mm探头(P/2型)，选取火龙果果实无鳞片的赤道部位进行穿刺测定，重复3次，取平均值，单位为N。
1.3.2 可滴定酸含量的测定
采用可滴定酸自动电位滴定仪测定。果肉匀浆后过滤，取滤液1mL，用去离子水定容至100mL。以0.05mol/LNa0H溶液滴定，记录滴定终点时所用碱溶液的体积，并计算可滴定酸含量，重复3次。
1.3.3 可溶性固形物含量的测
采用手持折射仪测定样品可溶性固形物含量，重复3次。
1.3.4 维生素C含量的测定
参考吴媛媛等的方法。称取1g火龙果研磨样，加入5％TCA溶液，混匀后离心。取上清液依次加入5％三氯乙酸、0.5％邻菲罗琳-乙醇溶液、0.5％磷酸-乙醇溶液、0.03％三氯化铁-乙醇溶液和1mL无水乙醇后于30℃水浴1h。用蒸馏水调零，以蒸馏水代替上清液为参比。在波长534nm处测定吸光度值，重复3次，单位为mg/100g。
1.3.5 总酚含量的测定
采用福林酚比色法，参考范智义等的方法，并作适当修改。称取火龙果研磨样1.0g，加入5.OmL60％乙醇浸提2h，10000×g离心15min，取上清液1mL至25mL具塞试管中，加入3mL1.0mol/L福林酚试剂后摇匀，静置5min后加入6mL7.5％碳酸钠，用蒸馏水定容至25mL。室温下在暗处放置2h，以不加没食子酸的样品为空白，于波长760nm处测定其吸光度值，重复3次，以没食子酸含量为标准物测定总酚含量，单位为μg/g。
1.3.6 可溶性糖含量的测定
参考曹健康等的苯酚一硫酸法，并作适当修改。称取火龙果研磨样1.0g，加入5。10mL蒸馏水后封口，于100℃水浴30min。冷却后过滤。滤液移入100mL容量瓶，回收残渣，加入5～10mL蒸馏水于100℃水浴10min后冷却、过滤，合并滤液。取500μL样品液于试管中。加入1.5mL蒸馏水和1.0mL9％苯酚，摇匀，在5～20s内加入5mL浓硫酸，摇匀，室温下反应30min，以空白为参比，在波长485nm处测定其吸光度值，重复3次。
1.3.7 有机酸组分的测定
1) 色谱条件
C18反相色谱柱(3.9mm×300mm，5μm)；柱温30℃；流动相为0.04mg/LKH2PO4-H3P04缓冲溶液：甲醇=95:5(体积比)；流速0.8mL/min；进样体积10μL；配有PDA检测器，检测波长214nm；外标法定量。
2) 提取方法
用高效液相色谱法，参考关秀杰等的方法，并作适当修改。称取火龙果研磨样5.0g于10mL容量瓶，加入一定量流动相，于75℃水浴45min，冷却至室温，定容。涡旋2min，超声提取15min，过滤分离蛋白质等大分子物质。取一定量滤液，离心10min后用0.45μm孔径的滤膜过滤上清液，备用。
1.3.8 NAD-MDH和NADP-ME酶活的测定
1)酶液提取
参考Masashi等和Hirai等的方法，稍作修改。取5g火龙果研磨样，加入10mL经预冷的研磨缓冲液(包含10mmol/L异抗坏血酸、0.6mol/L蔗糖、0.2mol，LTris-HCl，pH8.2)，低温离心后取上清液。用pH8.2的提取缓冲液(包含10mm01/L异抗坏血酸、0.1％曲拉通X-100、0.2mol/LTris-HCl)定容到50mL，混匀后用提取缓冲液定容至100mL，酶液低温保存备用。
2)酶活测定
NAD-MDH和NADP-ME酶活性测定参考Hirai等的方法。
1.3.9 PEPC酶活的测定
使用PEPC测定试剂盒测定样品中PEPC的酶活。
1.3.10 总RNA提取及检测
使用天根多糖多酚植物总RNA提取试剂盒提取火龙果总RNA。取1μLRNA通过核酸蛋白测定仪测定OD260/OD280比值检验RNA纯度，用普通琼脂糖凝胶电泳检验RNA完整性。
1.3.11 RT-qPCR分析
以总RNA为模版，采用诺维赞反转录试剂盒，在冰浴条件下进行第1链cDNA的合成。
苹果酸代谢相关基因引物(表1)通过Primer软件自主设计，检验引物熔解曲线单一(无特异性产物)后，可用于实时荧光定量分析。
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